骨缺损是口腔颌面部疾病的常见并发症，影响面部功能及美观。常用的骨缺损修复方法为自体骨移植、异体骨移植、组织工程骨等。自体骨移植的供体骨来源有限，手术周期长，术后并发症多。

    异体骨移植除具有自体骨移植的缺陷外，常还产生严重的排斥反应。骨组织工程技术具有抗原性低、手术创伤小及并发症少的优点。组织工程技术涉及种子细胞、支架材料及构建环境，其中选择优良的种子细胞至关重要。牙髓干细胞作为一类多能干细胞，凭借其多谱系分化、易获取、易保存、伦理争议性低的优点受到骨组织工程领域的广泛青睐。本文对牙髓干细胞成骨分化微环境中的细胞因子、支架材料及药物的研究进展进行综述。

    1.牙髓干细胞

    牙髓干细胞（dental pulp stem cell）是由Gronthos等首次从成人第三磨牙牙髓中分离并命名的一类细胞，具有自我更新与多谱系分化的潜能。在不同的诱导条件下，牙髓干细胞可以分化为成骨细胞、成牙本质细胞、神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、肝细胞以及胰腺细胞等。

    牙髓干细胞具有高度增殖能力，体外培养至20代以上仍保持干细胞特性。牙髓干细胞的来源非常广泛，可从临床拔除后废弃的成人第三磨牙、脱落乳牙及正畸减数牙牙髓中获取，伦理争议性低。相对于正常牙而言，从多生牙中获取的牙髓干细胞具有更高的增殖能力及分化潜能。

    Tang等发现猪牙髓干细胞不能刺激同种异体T细胞的增殖，说明其具有较低的免疫原性。其次，牙髓干细胞可以抑制T细胞与B细胞的增殖，增加调节性T细胞的数量，自身可分泌转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10及一氧化氮等物质，具有免疫调节功能。鉴于以上特质，牙髓干细胞在组织工程领域倍受关注。牙髓干细胞的分化需要适宜的微环境，其中细胞因子、支架材料及相关药物在牙髓干细胞的成骨分化中发挥关键作用。

    2.牙髓干细胞成骨相关微环境

    2.1 细胞因子

    2.1.1 TGF-β

    TGF-β是具有重要调控功能的蛋白质，通过与细胞膜上特异性受体结合，调节细胞生长及其他细胞功能。TGF-β可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞的凋亡，在一定浓度范围内可以抑制破骨细胞的活性。目前，在哺乳动物中至少发现TGF-β有4种亚型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2），各亚型的基因位点不同，其生物学效应也不尽相同。在使用TGF-β 1、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2处理小鼠胚胎成骨细胞以后，与成骨相关的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、胶原蛋白（collagen，COL）Ⅰ、骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达均明显上调，且呈现一定的剂量依赖性。

    杨毅用TGF-β2诱导兔骨髓间充质干细胞成骨分化时发现，当TGF-β2浓度为1 ng·mL-1时，骨髓间充质干细胞的增殖、成骨分化及矿化作用最强。Huojia等用TGF-β3处理牙髓干细胞后，OCN和COLⅠ表达上升，且呈现一定的剂量依赖性。此外，TGF-β可以抑制肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）α的表达，上调骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达，从而抑制破骨细胞的活性，间接促进成骨。

    2.1.2 BMP

    BMP是一类从骨基质中分离、提纯的疏水性糖蛋白，属于转化生长因子超家族。BMP具有广泛的生物学效应，参与调节多种细胞的增殖、迁移、黏附及分化。目前已经发现至少40种BMP家族成员，其中BMP2、BMP4、BMP7及BMP9具有促进成骨的效应。Aksel等在研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）联合BMP2诱导牙髓干细胞成骨分化的实验中发现，BMP2的浓度在10 ng·mL-1时具有最佳诱导效果。VEGF也具有良好的成骨诱导活性，其与BMP2的协同作用只发生在成骨分化早期（<7 d），后期则会抑制BMP2的活性。

    Taşlı等在人牙胚干细胞中分别过表达BMP2与BMP7，可促进人牙胚干细胞成骨分化，且两者具有相互促进的作用。BMP2促进牙髓干细胞成骨离不开核心结合因子（core binding factor，CBF）A2T2，沉默编码CBFA2T2的基因后，免疫共沉淀结果显示其与常染色质组蛋白甲基转移酶（euchromatic histonemethyl transference，EHMT）1相互作用，促进EHMT1表达，进而促进H3K9me2的甲基化水平，从而抑制成骨细胞特异性Runt相关性转录因子（Runt-related transcription factor，Runx）2启动子表达。因此，BMP2通过复杂的机制调控Runx2启动子表达水平，进而促进牙髓干细胞成骨。除此之外，BMP4与BMP9也被证实可以促进成骨。

    2.1.3 Runx2

    Runx2属于Runx家族，是一类与成骨相关的转录调控因子，Runx2的突变会导致颅骨锁骨发育不良。Runx2具有诱导干细胞成骨分化的潜能。Lee等用Runx2与编码锌指结构转录因子osterix的基因（Osx）转染脂肪干细胞后，其成骨相关基因表达上调，矿化能力增强。其中，Runx2的转染导致osterix表达上升，而osterix的转染对Runx2的表达无影响，提示Osx为Runx2的下游调控基因。在牵张成骨的研究中，将过表达Runx2基因的牙髓干细胞移植于兔骨缺损处，新生骨具有更高的骨密度与骨矿物质含量。

    Zhan等研究发现，OPG/核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信号通路在Runx2促进牙髓干细胞成骨分化中起关键作用。然而，Runx2的过表达会严重抑制成骨细胞的成熟及骨的形成，且促进骨的吸收。因此，Runx2可以促进未分化的干细胞成骨分化，在成骨分化后期，其调控作用减弱。合理控制Runx2在干细胞成骨分化各阶段的表达量将有助于干细胞更好地成骨。

    2.1.4 MSX1

    编码肌节同源盒（muscle segment homeobox，MSX）的基因属于HOX基因家族成员，MSX1是牙齿和骨组织发育的重要调节因子。Goto等发现沉默MSX1可以抑制牙髓干细胞成骨相关基因ALP、OCN、BMP2、Runx2的表达，可能的作用机制为通过沉默MSX1，从而诱导胆固醇合成相关基因的表达，促进牙髓干细胞脂肪向分化，抑制其成骨向分化。Xin等在对家族性少牙综合征的研究中发现，沉默MSX1后，牙髓干细胞的成骨及成牙能力下降，提示MSX1在牙髓干细胞的成骨分化中起重要调控作用。

    2.2 支架材料

    支架材料是组织工程的重要组成部分，起到机械支撑、组织塑形、信号载体等作用。常用的支架材料包括天然高分子材料、天然无机材料、合成高分子材料、合成无机材料及复合材料等。天然高分子材料主要为胶原、壳聚糖、明胶、葡聚糖等；天然无机材料包括磷酸钙、珊瑚羟磷灰石等；合成高分子材料主要有聚乳酸、聚乙醇酸、聚醚、硅橡胶等；合成无机材料主要有磷酸钙水泥、羟磷灰石、磷酸三钙、生物活性陶瓷等。复合材料则是各种材料合成的复合体。

    研究表明，相对于二维培养环境，牙髓干细胞在三维培养环境中具有更高的成骨与矿化能力，其中复合材料在牙髓干细胞的成骨分化中具有更好的作用。Kanafi等将牙髓干细胞固定在三维藻酸钙微球中，其矿化能力增强，成骨相关基因的表达明显上调。Xia等利用三氧化二铁纳米颗粒联合磷酸钙合成氧化铁纳米颗粒-磷酸钙水泥支架（IONP-CPC），发现种植在支架上的牙髓干细胞的成骨活性比单纯使用CPC支架出色。分析认为IONP-CPC支架的表面纳米拓扑结构起关键作用，其作为载体调节牙髓干细胞中各因子的吸收与释放。

    利用氟磷灰石复合聚己内酯组成氟磷灰石-聚己内酯纳米纤维支架，不仅可以增强牙髓干细胞的增殖与黏附能力，还能明显促进其成骨与矿化。于玲等通过把乳牙牙髓干细胞分别种植于羟磷灰石/β-磷酸三钙、羟磷灰石/胶原和羟磷灰石/聚乙丙交酯支架上，发现乳牙牙髓干细胞在羟磷灰石/聚乙丙交酯上的增殖、黏附及矿化能力更强，提示羟磷灰石/聚乙丙交酯支架能更好地促进乳牙牙髓干细胞成骨分化。

    2.3 药物

    药物作为促进剂或抑制剂调节牙髓干细胞的成骨分化。Yuan等用低于100 μg·mL-1的阿司匹林诱导牙髓干细胞成骨分化，发现与成骨相关的ALP、OCN、Runx2、COLⅠ的表达均上调，且阿司匹林联合牙髓干细胞处理组的大鼠颅骨缺损修复效果优于单纯使用牙髓干细胞组，提示阿司匹林可以促进牙髓干细胞的成骨分化。

    他汀类药物过去常用于心血管疾病的治疗，研究发现其可促进各种间充质细胞的成骨分化，包括成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等，其作用机制为促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞凋亡，以及抑制破骨细胞生成。雌二醇作为一种雌激素治疗剂，也具有促进成骨分化的作用。Wang等用一定浓度的雌二醇诱导牙髓干细胞成骨分化，发现其可通过核因子κB途径促进牙髓干细胞的成骨分化。此外，牛磺熊去氧胆酸、二氢杨梅素、丹参注射液及黄岑苷也可以促进牙髓干细胞的成骨分化。

    3.展望

    牙髓干细胞具有较好的成骨潜能，适宜浓度的细胞因子及药物在成骨不同阶段通过多种途径调控成骨过程，从而促进牙髓干细胞成骨。相对于二维环境，牙髓干细胞在三维环境中具有更高的增殖及矿化能力。融合各种传统材料优点合成的复合型支架材料在促进牙髓干细胞成骨中表现出更多的优势，是骨组织工程的又一新兴研究领域。尚需要更加深入探究各因素促进牙髓干细胞成骨的作用机制及各因素间的相互关系，提供一个牙髓干细胞成骨分化的最佳微环境，最大化地激发其成骨潜能，进而更好地服务于临床。