牙周病（periodontal disease）是由多种牙周致病菌引起的慢性、进行性牙周支持组织感染性疾病，在世界范围内均有较高的患病率，表现为牙龈红肿出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收等，严重时出现牙齿松动、移位，甚至脱落，是成人牙齿缺失的主要原因。牙周病不仅严重影响人类口腔健康，还与许多全身性疾病有着密切的关系。

    目前，牙周病治疗主要依赖药物、机械或引导组织再生技术，随着分子生物学、细胞学技术和组织工程学的飞速发展，牙周组织再生治疗成为牙周病治疗研究的热点。牙周组织再生治疗的三大要素为种子细胞、生长因子和支架材料，种子细胞是其最关键的部分之一。本文就种子细胞的研究现状和进展进行综述。

    1. 牙周组织再生治疗

    组织工程学（tissue engineering）是近年发展起来的一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。基本原理是从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将种子细胞从组织中分离出来在体外进行培养、扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物支架按一定的比例混合，使细胞黏附在生物支架上形成细胞-材料复合物，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。将组织工程技术引入牙周病的治疗，开辟了新的研究空间。牙周组织再生治疗就是将体外培养的高浓度、功能相关的活性细胞种植于具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上，在生长因子的作用下，经过一段时间的培养，将这种细胞与生物材料复合体植入机体牙周病损部位，以形成新的、具有其原来特殊形态和功能的相应牙周组织，达到修复创伤和重建功能的目的。牙周组织再生治疗的三大基本要素有种子细胞、生长因子和支架材料。

    种子细胞是进行牙周组织再生治疗的关键，一直是众多学者研究的热点。理想的种子细胞应具有以下特点：增殖、分化、传代能力强，可塑性好，植入机体后性能稳定，对受植区环境适应能力强，取材相对简便，对机体损伤小，无免疫排斥反应等。目前，用于牙周组织再生治疗的种子细胞来源有胚胎干细胞和成体干细胞，其中对成体干细胞（包括牙源性和非牙源性干细胞）研究较多。牙源性干细胞作为牙周组织再生治疗的种子细胞，引起了广泛的关注与重视。生长因子是一类生物活性因子，能够调节细胞生长、伤口愈合及组织再生。

    与牙周组织再生治疗相关的生长因子主要有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、釉基质蛋白（enamel matrix protein，EMP）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）等。不同种类的生长因子对牙周相关细胞合成能力有剂量增强效应，对牙周组织有选择性趋化作用，能调节和促进牙周组织的修复。

    支架材料也是牙周组织再生治疗非常重要的因素。支架载体应具备以下条件：良好的生物相容性、多孔性结构和高孔隙率、生物可降解性、良好的表面活性及可塑性。支架材料分为天然生物衍生材料和人工合成类材料。天然生物衍生材料主要来源于生物体，包括自体骨、同种异体脱矿松质骨、胶原、壳聚糖等；人工合成类材料包括：有机材料（如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物）、无机材料（如羟磷灰石、磷酸钙、β-磷酸三钙），以及纳米支架材料及其他复合类材料等。

    2. 种子细胞的生物学特性

    目前，用于牙周组织再生治疗的种子细胞主要是干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有以下生物学特性：1）全能或多能分化性，如胚胎类干细胞具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，成体干细胞通常具有多能性分化的特点，在特定环境诱导下，可分化为成牙骨质细胞、成骨细胞、胶原纤维细胞、脂肪细胞和软骨细胞等；2）自我更新能力，干细胞终生通过不均分裂进行自我更新和产生分化祖细胞；3）高度增殖能力，大多数干细胞即使处于G0 /G1期，即静止期和DNA合成前期，在体内具有高度克隆形成能力。

    胚胎干细胞与早期胚胎细胞形态、结构相似，细胞核大，有1个或几个核仁，细胞核多为常染色质，细胞质少；体外培养细胞排列紧密，集落状生长；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）染色呈棕红色，细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状，与周围存在明显界限，表面有折光较强的脂状小滴；时相专一性胚胎抗原（stage specific embryonicant，SSEA）是发育全能性的标志，碱性磷酸酶及端粒酶活性较高。成体干细胞种类较多，形态可能不一，体积一般较小，细胞质少，细胞核较大、数量少；存在于特定的微环境中，一般处于静止状态，不同细胞的标志物不同，一般表达基质类干细胞和/或胚胎干细胞的标志物，但大多数缺乏特定的鉴定标志，成体干细胞的数量与活性随年龄的增大而减少。

    3. 牙源性干细胞

    3.1 牙周膜干细胞

    牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell）是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，具有向成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞及未分化前体干细胞分化的能力，可进行迁移、增殖等一系列活动，与根面结合上皮形成牙龈附着，形成新生的牙周组织结构，在牙周组织再生中发挥极其重要的作用。Han等在SD大鼠模型上形成牙槽骨缺损，用同种异体牙周膜干细胞吸附明胶海绵形成牙周膜干细胞复合体，将此复合体放置于牙槽骨缺损中，分别在术后第7、14、21和28 d后进行组织学观察和免疫组织化学检查，发现其新骨形成时间和质量明显高于未放置牙周膜干细胞复合体组。

    Chen等采用单中心随机试验的方法将自体牙周膜干细胞结合牛源性骨矿物质材料治疗骨内缺损的牙周炎患者，试验组采用牙周膜干细胞结合Bio-Oss的引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR）治疗，对照组采用Bio-Oss的GTR治疗，经过12个月随访研究，结果发现自体牙周膜干细胞结合Bio-Oss的GTR治疗骨内缺损是一种安全、有效的方法。牙周膜干细胞是一种具有良好应用前景的种子细胞，因其细胞增殖、分化和再生数量较少，自体获取困难，尚不能满足临床需要。

    3.2 牙髓干细胞

    牙髓干细胞（dental pulp stem cell）是从牙髓组织分离出的一类干细胞，也是是目前研究较多的牙源性干细胞之一，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。Kabir等认为牙髓干细胞克隆能力较强，经不同细胞因子的诱导，可分化成不同细胞系，在一定条件下可形成成牙本质样结构。组织学分析显示，这种成牙本质样结构含有牙本质样小管和与天然牙牙周膜相似的胶原纤维。Ashri等从人第三磨牙牙髓中分离出牙髓干细胞，建立牙髓干细胞培养体系，发现牙髓干细胞可表达CD105、CD90、CD70，具有与间充质干细胞相似的生物学特性，牙髓干细胞在体外表达成骨细胞的活性（如碱性磷酸酶、茜素红S染色呈强阳性），并可形成矿化结节；牙髓干细胞植入有免疫缺陷的小鼠或兔，可形成牙本质-牙髓样复合体，是一种合适的牙周组织再生的种子细胞。但是，牙髓干细胞在牙髓组织中的定位目前还不完全明确，存在易老化、体外扩增培养难度大等不足。

    3.3 人脱落乳牙来源干细胞

    人类脱落的乳牙中含有许多干细胞。人脱落乳牙来源干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）具有高度增殖活性，能够分化为成牙本质细胞、成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等，有望成为自体干细胞治疗的新型来源。Miura等研究显示，在适宜条件下，SHED表达间充质细胞特异性标记物，如CD1 0 5 、CD90、CD146、CD44；也表达多种生长因子，如bFGF、TGF-β、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、BMP，参与细胞增殖和细胞外基质的形成。SHED在体外可分化为成牙本质细胞，诱导宿主产生成骨细胞，并具有骨诱导能力，高度表达N-钙黏着蛋白和R-钙黏着蛋白，但矿化组织仍保留SHED的梭形形态。Ma等深低温保存小鼠SHED，发现冷冻保存并不影响其生物学特性，说明SHED的获得不仅来源容易，冷冻保存SHED还能为其应用提供足够的细胞源。

    3.4 牙囊干细胞

    牙囊是发育牙胚中的一种外胚间充质组织。牙囊干细胞（dental follicle progenitor cell）起源于牙囊，是一类新近发现的牙源性干细胞，具有分化为成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞等的能力。Lucaciu等从牙囊组织中分离获取牙囊干细胞，发现牙囊干细胞与SHED均呈典型的成纤维样细胞形态，并且与其他牙源性干细胞的形态界限尚不明确。但是，牙囊干细胞表达SSEA-4、Oct3/4、Nanog、CD44、CD90，弱表达CD105、CD49；体外实验显示，可表达骨钙蛋白、骨桥蛋白和碱性磷酸酶；在钛植入体表面有较好的黏附能力；电子显微电镜观察、Ca2+和碱性磷酸酶检测充分说明，牙囊干细胞具有成骨分化的特性。

    Sowmya等从人牙囊组织中分离获得牙囊干细胞，研究显示牙囊干细胞表达胚胎干细胞标志物（如CD73、CD44、CD90），同时表达牙周膜细胞和成牙骨质细胞标志物（如胎盘碱性磷酸酶-1、FGF-2、牙骨质蛋白-1等）；在一定条件下培养后，均表现出成骨细胞、成牙周膜细胞、成牙骨质细胞的生物学特性。

    3.5 根尖乳头干细胞

    根尖乳头干细胞（stem cell from apical papilla）位于牙根尖乳头，是一群新近发现的多潜能干细胞，在牙根发育、根尖形成、牙髓/牙本质再生和生物牙根工程中发挥着潜在的作用。2008年，Huang等发现发育中牙的根尖存在一种间充质细胞，并将其定名为根尖乳头干细胞；这种细胞具有成牙质细胞的特性，可形成牙骨质，还可使年轻恒牙继续发育；推测其可望用于牙周组织再生和生物牙根工程。Diao等利用裸鼠测定成骨分化相关基因的分化潜能，发现WDR63在成骨分化中起着重要的调节作用，证明有WDR63活性标记的根尖乳头干细胞有助于促进牙周组织再生。Zhang等认为，Sir2相关酶类（sirtuin，SIRT）中的SIRT1对促进根尖乳头干细胞成骨分化起着重要的调节作用，并且当牙周膜干细胞和根尖乳头干细胞共同培养时，细胞体系的碱性磷酸酶表达、矿化能力、成骨细胞相关基因的表达明显增加，说明这2种细胞的共培养可以促进细胞增殖和成骨分化。

    3.6 牙槽骨来源干细胞

    1982年，Evian等在研究拔牙后牙槽窝愈合成骨的机制时，认为有一种相关的干细胞即牙槽骨来源干细胞（socket derived stem cell）起着重要作用，但未进行进一步的研究与证实。最近，这种细胞引起关注，认为牙槽骨来源干细胞是成体干细胞的一个重要的潜在来源。Nakajima等收集拔牙术后第3 d牙槽窝中的组织，成功获得牙槽骨来源干细胞，研究发现此种细胞表达CD44、CD90、CD271，在体外具有分化成骨、成脂肪和成软骨的能力。将这些牙槽骨来源干细胞自体移植到牙周缺损的动物模型中，可形成新骨、牙周纤维和类牙骨质结构，显示出牙周组织再生的应用潜力。

    Luo等从拔牙术后2周的比格犬的牙槽窝提取早期愈合组织，成功获得牙槽骨来源干细胞，利用小鼠骨髓基质系干细胞体系培养，体外实验显示牙槽骨来源干细胞可显著促进细胞迁移、趋化，增殖活动增强，碱性磷酸酶、骨涎蛋白表达上升；体内实验显示，根分叉缺损区可形成新骨和类牙骨质结构。

    4. 非牙源性干细胞

    4.1 骨髓基质干细胞

    骨髓基质系统含有少量的多功能基质干细胞，即骨髓基质干细胞（bone marrow stroma stem cell），具有多向分化的潜能。在特定的条下，可形成多种间充质细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及内皮细胞等；同时，骨髓基质干细胞用于体外培养时，存在易衰老、等待时间长、费用昂贵等诸多不足，限制了其临床应用。

    Zhou等建立了一个伴有牙槽骨缺损的嵌合子小鼠牙周炎模型，在缺损区植入骨髓基质干细胞+小牛骨复合物，通过活体成像、免疫组织化学方法，发现在第3、14和28 d，具有细胞表面标记的骨髓基质干细胞也表达于受伤组织和正常组织中，说明骨髓基质干细胞可能通过再生血管迁移到牙周缺损区。Li等在比格犬模型上造成根间分叉区骨缺损，在缺损区植入附有人类BMP-7基因转染的骨髓基质干细胞胶原膜，术后12周进行组织形态学观察，发现BMP-7基因转染的骨髓基质干细胞胶原膜区新骨的形成活跃，明显高于无骨髓基质干细胞组。

    4.2 脂肪干细胞

    脂肪干细胞（adipose derived stem cell）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有成脂肪、成软骨、成骨、成肌等多向分化的潜能。研究发现，脂肪干细胞在体外增殖稳定，取材容易、来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来的研究热点之一；但是，脂肪干细胞体外培养条件特殊，表型易发生改变。Tobita等从wistar大鼠体内收集脂肪细胞，分离、培养获得脂肪干细胞，将脂肪干细胞与富血小板血浆混合植入开窗法形成的wistar大鼠牙周缺损模型中，8周后发现wistar大鼠牙周缺损中有新骨、牙骨质和牙周纤维形成。

    Akita等从wistar大鼠体内收集脂肪细胞，分离、培养获得脂肪干细胞，将脂肪干细胞与聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]混合，将脂肪干细胞-PLGA混合物植入开窗法形成的wistar大鼠牙周缺损中，组织形态学及micro-CT观察均显示有活跃的新骨形成。

    5. 胚胎干细胞

    胚胎干细胞（embryonic stem cell）是一类具有自我更新和发育全能性，并产生分化后代能力的早期胚胎细胞。多向分化潜能是胚胎干细胞的主要特征，培养条件的略微变化就可诱导分化机制的启动。胚胎干细胞能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。目前，对胚胎干细胞向造血细胞、内皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肌细胞和神经细胞体外分化的研究已取得很大进展，也急需阐明其定向分化、基因组印迹和生物安全性。

    Yang等在猪牙周形成根分叉缺损模型，植入可表达聚醚砜（polyether sulphone，pES）/绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的胚胎干细胞和胶原膜，结果发现缺损区有新的牙周韧带和牙骨质形成，GFP也表达于牙周缺损修复区。Duan等将胚胎干细胞与EMD凝胶结合，体外实验显示胚胎干细胞-EMD凝胶复合体可显著提升Run相关转录因子（Runt-related transcription factor，Runx）2、成骨相关转录因子抗体（osterix，Osx）和骨钙素（osteocalcin）的mRNA水平，并有矿化结节形成；体内实验组织学观察显示，有更多的新骨、类牙骨和牙周纤维形成。

    6. 骨骼来源干细胞

    骨骼来源干细胞（skeletal stem cell）来源于骨骼末端快速分裂的细胞群，在多年以前就受到关注。在一定条件下，骨骼来源干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，而且其来源广泛。骨骼来源干细胞可从不同的组织中，使用各种方法分离获得，易于扩增。Dominici等建立了一套程序用以分离、鉴定骨骼来源干细胞：细胞在培养件下具有一定的黏附力，表达CD105、CD73和CD90，不表达造血细胞标记CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79和HLA-DR，体外有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的能力。骨骼来源干细胞的来源广泛并易于扩增，并具有形成牙周组织的潜能性，引起了许多牙周病学专家的浓厚兴趣，有望为牙周病治疗和牙周缺损修复与重建带来新的希望。

    7. 基因转染种子细胞

    近年来，有学者将特殊基因转染人种子细胞，使细胞自分泌某种特殊蛋白质和因子（如BMP、PDGF）以促进组织再生，其免疫原性、致癌性等也受到质疑。Cao等通过腺病毒载体将编码肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的基因转染克隆化培养的牙髓干细胞，获得HGF-牙髓干细胞；将这些永生化细胞应用于有牙周缺损的小猪动物模型上，放射学、骨定量和组织学观察结果显示，其效果明显优于无HGF基因转染组。

    尚姝环等将带有人类血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-β的cDNA的腺病毒体外转染牙周膜干细胞，获得永生化牙周膜干细胞；通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]法检测细胞的增殖，通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测编码Ⅰ型胶原蛋白的基因的表达，发现PDGF-β具有增强牙周膜干细胞增殖、上调Ⅰ型胶原蛋白表达的作用。上述研究表明基因转染种子细胞是非常有应用前景的种子细胞来源。

    8. 种子细胞的临床应用及展望

    长期以来，为寻求一种理想的方法来修复病损的牙周组织，进行了大量的研究。将分子生物学、细胞学技术和组织工程学应用于牙周病的治疗，为牙周组织再生治疗开辟了新领域。应用于牙周组织再生治疗的种子细胞取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖能力强、易稳定表达细胞表型；植入体内后能耐受机体免疫，大部分细胞不存在伦理争议等，可快速产生成骨、成牙骨质、成牙周纤维等，且无致瘤性，为牙周病治疗带来了新希望。

    但是，牙周组织再生治疗的种子细胞应用性研究尚处于起步阶段，仍有许多问题亟待解决：如目前种子细胞来源有限，寻求种子细胞的多种来源途径是需面对的重要问题；细胞分离技术单一，且种子细胞常缺乏明确标志物，纯化并鉴定种子细胞的技术需要进一步提高，诱导分化技术和培养条件尚需进一步改进；虽然种子细胞均有较强的分化克隆能力，但其数量常显不足，种子细胞同样可表现出一定的异质性；此外，种子细胞的取材、保存、培养所需时间和牙周组织工程动物实验模型等还需进一步完善。

    基因修饰技术使用前必须解决以下问题：重组病毒载体的免疫原性、致癌性，转染细胞必需分泌足够的细胞因子，机体对分泌的细胞因子有较好的反应能力，转染细胞无致瘤性等。此外，由于实体环境非常复杂，微环境、药物、年龄因素、Wnt通路、炎症及免疫因素均可影响种子细胞向特定细胞的分化；牙周炎症可破坏牙周组织再生，又可促进种子细胞增殖活动，但同时又抑制其向特定细胞分化的能力；获得的种子细胞数量常常不足；有些种子细胞（如骨髓间充质干细胞）因来源问题限制了其广泛的临床应用，胚胎干细胞受伦理和法律的限制，细胞来源问题受到限制；牙周组织再生治疗后，在恢复牙周组织的生理结构和功能上还远未达到所期望的目标。

    目前，牙周组织工程相关的技术研究处于基础实验研究阶段，尚未形成一套成熟有效的程序，需要多学科、跨专业的技术联合与协作，最终实现由基础实验到临床应用转变这一目标。相信通过研究者的努力，牙周组织再生治疗的应用会更成熟，为人类的健康造福，有着巨大的潜力和广阔的应用前景。